Μικροοργανισμοί και αντιβιοτικά: διασπορά ανθεκτικών βακτηρίων και των αντίστοιχων γονιδίων τους στο υδάτινο περιβάλλον

Abstract

Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται σταθερή ανάπτυξη της ανησυχίας στην επιστημονική κοινότητα και στο ευρύ κοινό, όσον αφορά την ανάπτυξη ανθεκτικότητας βακτηρίων στα αντιβιοτικά. Το πρόβλημα αναδείχθηκε με την εμφάνιση πολυανθεκτικών βακτηρίων τα οποία, πλέον, συνιστούν μια νέα μορφή πανδημίας. Συγκεκριμένα, η Ελλάδα συγκαταλέγεται στις ευρωπαϊκές χώρες με τα υψηλότερα επίπεδα μικροβιακής αντοχής, γεγονός που πιθανότατα συνδέεται με την υψηλή κατανάλωση αντιβιοτικών (ESAC). Ύπαρξη γονιδίων ανθεκτικότητας εντοπίζεται όχι μόνο σε κλινικά στελέχη αλλά και σε περιβαλλοντικά, γεγονός που καταδεικνύει την έκταση του προβλήματος. Η περιβαλλοντική διάσταση του προβλήματος, αφορά την μεταφορά και την εξάπλωση γονιδίων ανθεκτικότητας μέσω της χρήσης και της μεταφοράς αντιβιοτικών στο περιβάλλον. Τα πιο σημαντικά περιβάλλοντα, άμεσα επηρεαζόμενα από την ανθρωπογενή δραστηριότητα, είναι οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων και τα εκτροφεία ζώων (Pruden & Arabi 2012). Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν ο έλεγχος της ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά περιβαλλοντικών βακτηριακών στελεχών, καθώς και η απομόνωση και ταυτοποίηση γονιδίων ανθεκτικότητας. Η δειγματοληψία έγινε κατά τους μήνες Μάιο, Ιούνιο και Σεπτέμβριο του 2014, από θαλασσινό νερό, είσοδο και έξοδο δύο εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυμάτων, νερό ιδιωτικών πισινών και μίας πισίνας αθλητικής εγκατάστασης, και από τα κόπρανα ενός ορνιθοτροφείου, στην ευρύτερη περιοχή των Χανίων. Τα στελέχη που απομονώθηκαν ανήκουν στις οικογένειες Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae και Enterococcaceae. Οι αντιβιοτικές ουσίες που εξετάστηκαν είναι: η Ampicillin (Penicillins), η Cefaclor (2ης γενιάς Cephalosporine), η Imipenem (Carbapenems) και η Tetracycline. Η ανθεκτικότητα των μικροοργανισμών εξετάστηκε βάσει της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration – MIC). Η μέθοδος που εφαρμόστηκε για την χαρτογράφηση της ανθεκτικότητας των μικροοργανισμών είναι η μικρομέθοδος αραιώσεων σε ζωμό (Broth Microdillution Method), βάσει πρωτοκόλλου CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Ακολούθησε ανίχνευση των σημαντικότερων γονιδίων ανθεκτικότητας στα απομονωμένα στελέχη, μέσω της απομόνωσης του γενετικού υλικού τους και στη συνέχεια μέσω της μεθόδου Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR – Polymerase Chain Reaction), για την απομόνωση γνωστών τμημάτων του γονιδιώματος.

Στην Ampicillin εμφανίστηκε η υψηλότερη ανθεκτικότητα, καθώς μόνο το 22.72 % των στελεχών παρουσίασε θνησιμότητα κατά την επίδρασή της. Το δεύτερο υψηλότερο ποσοστό ανθεκτικότητας εμφανίστηκε στην Τετρακυκλίνη (68.18%), όπου τα περισσότερα ανθεκτικά στελέχη ανήκαν στην οικογένεια των εντερόκοκκων. Στην ουσία Cefaclor, εμφανίστηκαν μέτρια ποσοστά ανθεκτικότητας (40.9%). Η Ιμιπενέμη αποδείχθηκε ο πιο αποτελεσματικός αντιβιοτικός παράγοντας στην καταπολέμηση των μικροοργανισμών, καθώς όλα τα στελέχη παρουσίασαν τουλάχιστον μέτρια ευαισθησία και πολύ χαμηλές τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης. Σε πολλά βακτηριακά είδη παρουσιάστηκε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε στελέχη που προέρχονταν από εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων, γεγονός που υποδεικνύει την προφανή σύνδεση ανάμεσα στην προέλευση των συγκεκριμένων στελεχών από ανθρωπογενείς δραστηριότητες και στην εμφάνιση της ανθεκτικότητας. Το φαινόμενο αυτό συμφωνεί με την θεωρία της μεταφοράς γονιδίων ανθεκτικότητας από ανθρωπογενείς δραστηριότητες στο περιβάλλον μέσα από την μεταφορά των υγρών λυμάτων αλλά και μέσω της χρήσης των αντιβιοτικών στην γεωργία και κτηνοτροφία. Ωστόσο, υπήρξαν και λίγες περιπτώσεις όπου στελέχη θαλασσινού δείγματος είχαν πολύ μεγαλύτερη ανθεκτικότητα από στελέχη προερχόμενα από περιβάλλοντα άμεσα επηρεαζόμενα από τις ανθρωπογενείς δραστηριότητες. Το φαινόμενο αυτό δικαιολογείται από το γεγονός ότι η ανθεκτικότητα μπορεί να εμφανιστεί και απουσία αντιβιοτικών ουσιών, καθώς η ανάπτυξη γονιδίων ανθεκτικότητας επηρεάζεται και από περιβαλλοντικούς παράγοντες αλλά πολλές φορές οφείλεται και σε εγγενείς μηχανισμούς των βακτηρίων που συμβάλλουν στην επιβίωσή τους σε σκληρά περιβάλλοντα. Ωστόσο, σίγουρα υποδηλώνεται η επίδραση των ανθρωπογενών δραστηριοτήτων στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στο περιβάλλον. Εμφανίστηκε πληθώρα γονιδίων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά β-λακταμών και Τετρακυκλινών. Τα κύρια γονίδια ανθεκτικότητας ήταν το blaTEM στις β-λακτάμες και το ΤΕΤΒ στις Τετρακυκλίνες. Κυρίαρχη ήταν η παρουσία των γονιδίων αυτών σε Ε.Ε.Υ.Α., γεγονός που είναι ανησυχητικό καθώς η επεξεργασία των λυμάτων συχνά δε συντελεί στην καταστροφή των γονιδίων αυτών (Yuan, et al., 2015), με αποτέλεσμα να καταλήγουν στο περιβάλλον.