Βιογεωγραφία βακτηρίων και αφθονία λειτουργικών γονιδίων στη Λεκάνη Απορροής του Ποταμού Κοιλιάρη

Abstract

Οι μικροοργανισμοί του εδάφους κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στους βιογεωχημικούς κύκλους των θρεπτικών στοιχείων και κατά συνέπεια στη λειτουργία και παραγωγικότητα των φυσικών αλλά και ανθρωπογενών οικοσυστημάτων. Είναι κρίσιμη λοιπόν η κατανόηση των παραμέτρων, βιοτικών και αβιοτικών, που επηρεάζουν τα μοτίβα της χωρικής κατανομής των μικροβιακών κοινοτήτων ώστε να είναι εφικτή η πρόβλεψη της απόκρισης τους στην κλιματική αλλαγή αλλά και σε ανθρωπογενείς επεμβάσεις, καθώς επίσης για την ανάπτυξη κατάλληλων “εργαλείων” πρόβλεψης των διεργασιών που εμπλέκονται οι μικροοργανισμοί του εδάφους. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη, σε μεγάλη κλίμακα (λεκάνη απορροής), των διακυμάνσεων της κατανομής της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους. Για τον στόχο αυτό, η μικροβιακή κοινότητα, μελετήθηκε με την χρήση φυλογενετικών δεικτών και λειτουργικών γονιδίων καθώς επίσης και προσδιορίστηκαν βιογεωχημικές διεργασίες (ρυθμός νιτροποίησης και ανοργανοποίησης C, ενεργότητα ενζύμων) και οι παράγοντες που επιδρούν σε αυτήν (περιβάλλον, κλίμα, χρήσεις γης, ιδιότητες και βάθος εδάφους, χρόνος). Τα αποτελέσματα της διατριβής ερμηνεύτηκαν συνδυάζοντας τα αποτελέσματα των μοριακών αναλύσεων (qPCR, 16S rRNA αλληλούχιση) με μετρήσεις φυσικοχημικών και βιοχημικών παραμέτρων, χρησιμοποιώντας προηγμένες μεθόδους στατιστικής και γεωστατιστικής ανάλυσης. Αρχικά, ο ολικός οργανικός C (TOC) και το pH αναγνωρίστηκαν ως οι σημαντικότερες περιβαλλοντικές παράμετροι που συσχετίζονται με την κατανομή της αφθονίας των μικροβιακών τάξων, καθώς επίσης και παρέχονται ενδείξεις ύπαρξης οικολογικής συνοχής και συντροφικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μικροβιακών τάξων, σε επίπεδο λεκάνης απορροής. Η συγκρότηση της μικροβιακής κοινότητας βρέθηκε να διέπεται κυρίως από στοχαστικές διαδικασίες και ειδικότερα από ένα συνδυασμό τυχαίων μεταναστεύσεων, γεννήσεων και θανάτων και διασποράς. Στην συνέχεια, η εφαρμογή μηχανικών μεθόδων μάθησης έδειξε πως οι χρήσεις γης και το βάθος του εδάφους μπορεί να κατηγοριοποιηθεί με βάση τη δομή της μικροβιακής κοινότητας σε υψηλό ταξινομικό επίπεδο. Η ανάλυση των δικτύων για τις χρήσεις γης και τα εδαφικά βάθη, ανέδειξαν στοιχεία σχετικά με τις σχέσεις αλληλεπίδρασης των μικροοργανισμών αλλά και τον πιθανό ρόλο τους στους βιογεωχημικούς κύκλους του C και N για την περιοχή μελέτης μας. Πιο συγκεκριμένα, για τον κύκλο του Ν, μελετήθηκαν οι διάφορες διεργασίες του στην περιοχή του ποταμού Κοιλιάρη και οι περιβαλλοντικές παράμετροι που τις επηρεάζουν, μέσω της ποσοτικοποίησης των λειτουργικών γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτές. Υπολογίστηκε η αφθονία των αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων, των οξειδωτών της αμμωνίας και των απονιτροποιητών, συμπεριλαμβανομένου και του πρόσφατα αναγνωρισμένου clade II του γονιδίου nosZ. Οι περιβαλλοντικές παράμετροι που προσδιορίστηκαν, με σημαντικότερη το pH, εξήγησαν μέχρι και το 80% της διακύμανσης της αφθονίας των λειτουργικών ομάδων και οι χρήσεις γης βρέθηκε να καθορίζουν την ισχύ και το είδος των σχέσεων που παρατηρήθηκαν μεταξύ των λειτουργικών ομάδων.The microorganisms drive the nutrient biogeochemical cycles, ecosystems functioning and the delivered by them services. Understanding the environmental variables that drive the spatial distribution patterns of microbial communities is crucial to anticipate ecosystem responses to global changes, to human perturbation and to develop proper tools for predicting their functioning. The objective of this PhD Thesis was to characterize the variations of the distribution of soil microbial community and to investigate the factors that affect that distribution, at the scale of the watershed, by adopting phylogenetic (16SrRNA) and functional gene (N cycle) data. This study investigated the distribution of Archaea, Bacteria and Fungi as well as the dominant bacterial phyla (Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes), and classes of Proteobacteria (Alpha- and Betaproteobacteria) across the Koiliaris watershed by qPCR and linked them with environmental variables. Predictive maps of microorganisms’ distribution at watershed scale were generated by co-kriging, using the most significant predictors. Our findings showed that 31–79% of the spatial variation in microbial taxa abundance could be explained by the parameters measured, with total organic carbon and pH being identified as the most important. Moreover, strong correlations were set between microbial groups. Our findings shed light on the factors shaping microbial communities at a high taxonomic level and provide evidence for ecological coherence and syntrophic interactions at the watershed scale. In the following step, a next-generation, Illumina-based sequencing approach was employed to characterize the bacterial community within a 3-year field sampling campaigns, from 22 sites including two soil depths (0-15 and 15-30 cm). The interannual variation patterns that observed for α- and β-diversity attributed mainly to climatic variations. Land use and soil depth explained 14 and 2%, respectively, of the β-diversity variations, while they had not any effect on α- diversity metrics. Moreover, environmental variations and geographic distance showed a weak correlations with both biodiversity levels. This led as to consider that other processes drive the community assembly. In fact, fitting the Sloan’s neutral community assembly model to our data, provided a very good prediction of R2=0.84. Even, the community found to be assembled mainly by stochastic processes, there were indices for environmental influences at a more local scale. Machinelearning approaches demonstrated that agricultural lands were enriched with Proteobacteria, XII Acidobacteria, Bacteroidetes, Elusimicrobia, OD1 and WS3, while natural ecosystems with Verrucomicrobia, Actinobacteria, Chlotoflexi, Firmicutes, AD3 and Gemmatimonadetes. Network analysis revealed non-random co-occurrence patterns for discriminant communities of each land use and soil depth. Moreover, for all networks, except that of 15-30 cm, keystone OTUs was members of model sub community that occurred more frequently that the model’s prediction. Emphasis was also given on functional microorganism regulating the cycling of N (diazotrophs, ammonia oxidizers, denitrifiers) and on the environmental factors shaping their biogeographic patterns across the Koiliaris watershed. Our findings revealed that a proportion of variance ranging from 40 to 80% of functional genes abundance could be explained by the environmental variables monitored, with pH, soil texture, total organic carbon and potential nitrification rate being identified as the most important drivers. Prediction maps, generated by cokriging, revealed distinct patterns of functional genes. Strong relationships were set between functional groups, which were further mediated by the land use (natural vs agricultural lands). These relationships, in combination with the environmental variables, allow us to provide insights regarding the ecological preferences of N-functional groups and among them the recently identified clade II of nitrous oxide reducers.